文章来源：生辉SynBio
合成生物学涉及到了对微生物代谢系统的改变甚至重构，基因编辑和高通量测序是重要的支撑技术。CRISPR-Cas9基因编辑技术被形象地称为 “基因剪刀”，该技术自2012年问世至2020年获得诺贝尔化学奖，仅历时8年。
目前，CRISPR-Cas9技术已广泛应用于生命科学研究的诸多领域。自2013年张锋在Science上发表论文，首次将CRISPR/Cas9基因编辑技术改进并应用于哺乳动物和人类细胞以来，CRISPR基因编辑技术开始在遗传病治疗和肿瘤治疗领域大放异彩。
就在去年，中国首个基因编辑治疗地中海贫血临床试验申请已经获批。地中海贫血是世界上分布最广、患病人数最多的单基因遗传病，也是我国影响最大、发病率最高的遗传病。仅在中国，就有大约3000万地中海贫血基因携带者。
CRISPR-Cas9的技术原理包括向导RNA引导的Cas9靶向DNA切割和DNA修复两个基本过程。之前的研究发现，CRISPR-Cas9编辑哺乳动物细胞的DNA修复结果以插入/缺失为主，少量的染色体重排和碱基替代并未受到重视。
为了避免基因编辑技术在基因治疗中产生非预期的副作用，发展无脱靶、精确可控的基因编辑技术极为重要，充分认识CRISPR-Cas9编辑介导的DNA修复结果有助于技术的发展。
中国科学院青岛生物能源与过程研究所的王士安研究员在开展红法夫酵母基因编辑研究中，发现了高频的碱基替代（点突变）修复，并由此系统地开展了CRISPR-Cas9介导的DNA修复结果分析和机制探究。相关论文发表在CRISPR期刊上，题为 “Comprehensive Analysis of CRISPR-Cas9 Editing Outcomes in Yeast Xanthophyllomyces dendrorhous”。
“我们想到，这一现象同样可能发生在应用于人体的治疗过程中，非预期的点突变可能会造成不可控的后果。我们期望通过论文的发表，能够带动更多的研究人员关注这类修复结果。” 王士安这样告诉生辉SynBio。
王士安2003年毕业于陕西师范大学生物科学专业；同年考入中科院微生物研究所微生物学专业（硕博连读），开展酵母菌资源和分子系统学研究；2008年博士毕业后到中科院青岛生物能源与过程研究所工作至今，主要研究方向为酵母菌生物技术（Yeast Biotechnology）；工作期间，2013年至2014年，赴美国麻省理工学院化工系学习代谢工程。目前，主要聚焦GRAS级（通常认为安全）酵母底盘，开展油脂和蛋白合成研究。
“目前精确基因编辑仍然难以实现”
“我们在开展红法夫酵母基因编辑研究中发现了高频的碱基替代（点突变）修复，经验证其不是随机发生的，而是在特定靶点出现的点突变。”
王士安团队由此系统地开展了CRISPR-Cas9介导的DNA修复结果分析和机制探究。
团队从转化CRISPR-Cas9的102万个红法夫酵母转化子中鉴定到476个自然修复克隆采用Sanger测序、Illumina测序、序列结构变异分析、染色体核型分析、遗传突变分析和统计分析等方法，全面分析了DNA修复类型，并系统探究了修复产生的原因。
结果发现，在红法夫酵母中CRISPR-Cas9基因编辑介导的DNA修复类型多种多样，包括DNA插入/缺失、点突变、染色体易位、短片段反向互补等，并展现了多种新特征。其中，1 kb以上的DNA缺失并不罕见；点突变非随机地出现在特定靶位点，这不同于在Hela细胞和酿酒酵母中鉴定到的少量碱基替代；染色体易位重复性地发生在两个DNA断裂处。
图丨基因组深度测序鉴定基因编辑中的点突变（来源：CRISPR）
研究还发现，点突变和DNA缺失强烈依赖NHEJ修复途径中的Ku70、Ku80、Mre11和RAD50基因，失活其中任何一个基因都导致DNA修复能力急剧下降。并且，点突变和DNA缺失还依赖非保真DNA聚合酶REV3或Pol4，同时失活REV3和POL4基因也导致DNA修复能力明显下降。
他表示，尽管CRISPR-Cas9基因编辑技术已经产生了革命性影响，但是在基因治疗领域的应用还需要更加谨慎，目前精确基因编辑仍然难以实现。
“该项研究虽然以微生物为对象，但是对哺乳动物细胞的基因编辑研究也具有启发作用。与该研究发现具有类似性，人类癌症细胞中的大量点突变由非保真DNA聚合酶产生，并且人体细胞以NHEJ为主要的DNA修复机制。然而，以往研究并未足够重视CRISPR-Cas9介导的人体细胞的自然DNA修复类型，尤其是点突变，相关研究应予以加强，以确保基因编辑技术在疾病治疗中的安全应用。届时，该研究会指导CRISPR系统在基因治疗中的具体操作，包括通过计算的方式选择靶点，或者精确的体外评价。”
“此外，我们的研究预示，CRISPR-Cas9基因编辑系统整合在红法夫酵母中表达，酵母细胞很可能存在一种抵抗CRISPR-Cas9切割DNA的内在机制，该机制还有待进一步研究。”王士安补充道。
基因编辑的DNA 修复模型（CRISPR 论文）
实际上，红法夫酵母仅是王士安的研究对象之一。其研究涉及子囊菌酵母和担子菌酵母的多个品种。
子囊菌酵母和担子菌酵母是酵母菌的两个主要分类群，分类上的关键区别在于有性生殖方式的差异。目前，两类酵母共发现了2000多种。
相比而言，子囊菌酵母比担子菌酵母受到的关注更多，国家食品菌种目录中的酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母都属于子囊菌酵母；饲料菌种目录中的红法夫酵母属于担子菌酵母。
子囊菌酵母的研究手段更多，知识背景更清楚；担子菌酵母的研究开发技术则相对落后。但是，合成生物学的发展有望大力推动担子菌酵母的研究技术开发和产业应用。
两类酵母的优势领域也不同。子囊菌酵母在蛋白表达、生物化工品合成等方面具备优势，而担子菌酵母在原料有效利用、次级代谢产物合成、污染物降解等方面有很大应用潜力。所以，王士安认为，“因菌制宜” 应该是更好利用酵母菌资源的方式，当然对于非模式生物，技术的发展是应用开发的重要基础。
两项技术已实现成果转化
目前，王士安团队有两个主要的研究方向，分别是酵母合成油脂和毕赤酵母表达蛋白。
微生物油脂在医药健康和能源化工领域具有重要应用价值。
神经酸是功能油脂中的一种超长链单不饱和脂肪酸，既可以用作药物，治疗神经系统多发性硬化症，也可以用作功能性食品添加剂，具有缓解帕金森运动紊乱、改善脑梗患者认知、促进受损神经系统康复等作用。目前，神经酸受到企业和医院的广泛关注。
王士安团队系统开展了产油酵母代谢工程研究，利用解脂耶氏酵母合成神经酸，目前油脂产量达到100 g/L，神经酸达到17 g/L，是已知的最高水平，已与浙江震元制药有限公司开展了合作开发，申请了2项PCT国际专利。并且，该项目也受到其它头部企业的高度重视，多方合作正在推进中。
王士安团队同时也在开展红法夫酵母合成虾青素的工作。虾青素因具有强抗氧化性而被民众熟知。不过，目前他们的研究面向的不是化妆品和保健品市场，而是畜禽水产养殖行业。高质量的养殖和高品质的畜禽水产产品的需求不断增加，红法夫酵母虾青素是优质的饲料添加剂，不仅防病抗病，还能够增加产品的色泽。
团队前期针对红法夫酵母遗传平台成熟度低的问题，重点开展了技术开发工作，先后建立了菌株倍性分析方法、遗传标记去除技术和CRISPR-Cas9基因编辑技术等，也发展了室温等离子体诱变、流式细胞术和拉曼高通量筛选方法。基于方法的优势，与福建绿康生化开展了技术合作，目前产品已应用于水产养殖。
团队另一个主要的研究方向是毕赤酵母表达蛋白。
毕赤酵母蛋白表达系统虽然是传统体系，但是合成生物学的发展和人们的新需求赋予了该系统新的使命。合成生物技术的进步使得系统解析毕赤酵母遗传和生理代谢信息，发展新型毕赤酵母蛋白表达底盘具备了可行性。
目前，王士安团队正在重点开展利用毕赤酵母表达人溶菌酶的相关研究。人溶菌酶具有独特的优越性和显著的抗菌药理作用效果，在临床上具有多种重要应用价值，也可以应用于食品、饲料等方面，替代传统的抗生素。但获取天然来源的人溶菌酶成本仍然很高，这也是王士安团队想要解决的问题。
“这方面我们起步稍晚，但是我们的思路是希望在平台上做得更扎实，在对底盘的理解上做得更深入。并且，我们所做的是完全无标记的、符合医药法规可应用于人体的人溶菌酶生产。”王士安告诉生辉SynBio。
毕赤酵母表达蛋白类药物具有耗时短、经济高效、产量高等特点。重要的是，在目标产物的生产过程中，其自身分泌蛋白非常少，易于纯化，能够节约大量成本。
最近，基于毕赤酵母蛋白表达系统的特点，提出了“台式制造（Benchtop scale manufacturing）” 模式，即在一个小尺寸的试验台上就可实现药物的设计-制造-纯化-成品过程。
其重要意义在于，考虑到盈利问题，很多大的药企瞄准的药物市场主要是市值足够大、病人群体足够多的，对于众多的小群体疾病种类、罕见病、低值药物则关注较少。而台式制造使用酵母系统，能够短时间、小范围的、小产量地生产这一类药品，弥补大的药企所遗漏的利基市场。
“不过，这种台式制造在医药行业的应用也面临一些法规问题，比如药的专利期、如何审批等，这是需要接下来持续推进的。”王士安说。
“我们团队的计划是进一步把系统和平台做得更成熟，目前一边系统性地挖掘和认识底盘内在的影响蛋白表达调控的基因，一边进行技术研发和蛋白高产工作。”
诸如此类的新技术新需求还将继续涌现，毕赤酵母蛋白表达系统不仅用于医用蛋白的表达，还包括大量的工业用酶，甚至人造肉等蛋白食品也有望利用该系统得以生产。
“合成生物学研究正处于快速发展阶段”
2013年时，王士安曾赴美国麻省理工学院访学，进入代谢工程学科创始人之一Gregory Stephanopoulos院士的实验室学习代谢工程，为期一年。因此其对于合成生物学的看法，也深深受到Gregory Stephanopoulos院士的影响。
他表示，狭义的合成生物学常指合成生命、合成染色体、基因电路等，具有生物、工程、电子、信息等多学科交叉概念的研究范畴。现在我们所说的合成生物学多指广义概念，除了狭义合成生物学的范畴，还囊括了以往的基因工程、遗传工程、代谢工程和近年出现的基因编辑新技术等。
无论哪种概念，合成生物学无疑为科研人员和大众生活带来了巨大变化，合成生物学被认为将带来继分子生物学革命和基因组学革命之后的第三次生物科学革命。据麦肯锡预测，至2025年合成生物技术产品的全球市场规模将超过7000亿美元。
他还表示，作为一名科研人员，我们能感受到合成生物学带来的观念冲击和思想解放。以往，生物合成某些产品的产量仅在微克级，现在应用合成生物学手段可以达到克级，有些产品超过了100克/升，这在以前是难以想象的。
但是，合成生物学的发展也不可能一蹴而就，尤其是规模化和商业化应用。这一学科和技术的发展也需要更多的包容，有些合成生物学相关的基础研究和基础技术开发并不能在短期内见到经济效益，但并不能抹杀相关研究的意义，也不建议急于向此类研究要经济价值。
合成生物学在带来革命性影响的同时，也存在与法律法规不协同的现实情况，尤其是食品、饲料等方面的法规。合成生物学与遗传修饰生物、转基因、合成产物、传统诱变等概念的界定与区别，安全性评价规范、法规修订跟进等还有待加强。
此外，合成生物学相关的伦理问题已经出现过大的负面事件，科学研究中的伦理问题也不可忽视。合成生物学研究正处于快速发展阶段，有些应用于人体的研究应当更加谨慎，新知识可能改变以往的技术和观念，我们的CRISPR-Cas9研究结果给予启示，基因编辑技术应用于人体细胞是否发生低频的点突变修复？该问题值得重视，以确保基因编辑技术在疾病治疗中的安全应用。
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