由O-去甲基化酶催化的木质素单体化合物O-去甲基化反应是木质素生物降解利用过程中的关键步骤之一。目前已知的O-去甲基化酶仅有Rieske加氧酶、四氢叶酸(THF)依赖性的O-去甲基化酶、P450单加氧酶几种，且普遍存在着底物特异性狭窄、反应机理不清和缺乏还原酶伴侣等问题，不能满足工业化应用的需求。因此无论是挖掘新的O-去甲基化酶基因资源，还是通过蛋白质工程改造现有的O-去甲基化酶均具有重要意义。

来源于沼泽红假单胞菌HaA2菌株产生的细胞色素CYP199A4单加氧酶是少数已知能够催化木质素单体衍生物去甲基化反应的P450酶之一，然而其去甲基化催化功能高度依赖烟酰胺辅因子NADH和还原伴侣蛋白。最近，青岛能源所丛志奇研究员团队在国际上首次提出“H₂O₂隧道工程策略”（J. Am. Chem. Soc. 2023，145(9): 5506-5511），通过对P450酶固有水隧道的蛋白质工程改造，将包括CYP199A4和CYP153A_M.aq等NADH依赖型P450单加氧酶改造为可以直接利用H₂O₂的过加氧酶，为P450过加氧酶元件创制提供了一个普适性的新策略。然而，工程化CYP199A4过加氧酶的底物作用范围仍不明确，产生过加氧酶活性的结构基础与分子机制也不清楚。

图1：关键门控残基效应增强工程化CYP199A4去甲基化过加氧酶活性

最近，研究人员利用H₂O₂隧道工程策略构建了CYP199A4过氧化氢突变酶库，对21种木质素单体类似物的O-去甲基化进行研究，首次成功构建了木质素单体类似物间位甲氧基O-去甲基化活性的工程化P450过加氧酶。对于供电子或吸电子基团（甲氧基、硝基、羟基和甲基）取代的木质素单体类似物的O-去甲基化反应中，工程化CYP199A4过加氧酶优先在其对位进行催化反应，反应总转化数（TON）已超过或媲美天然底物4-甲氧基苯甲酸的脱甲基化反应。典型突变体实现3-甲基-4-羟基苯甲酸的半规模制备，分离产率为59 %。研究人员随即解析了优势突变体的高分辨率晶体结构，结构分析显示具有较小位阻和疏水性关键门控残基的突变酶活性中心的H₂O分子总数增加。因为H₂O₂和H₂O分子具有相似的物理性质，这说明H₂O₂分子也可以更容易进入到活性中心，从而在分子水平上有力支持了门控氨基酸残基调节H₂O₂分子参与反应的可能机制。研究人员进一步采用经典动力学模拟及增强采样技术，对H₂O₂穿越隧道的能垒进行计算，揭示相较于野生型，F182A突变体的隧道势垒显著降低，增强了H₂O/H₂O₂分子穿越隧道并抵达血红素活性中心的能力，从微观层面上为H₂O₂隧道工程策略的有效性提供了明确的理论阐释。这项研究为开发非天然P450过氧化酶进行有价值化合物的有机转化提供了新思路，为利用H₂O₂隧道工程创建P450过加氧酶的机理上提供了新的见解，有望进一步拓展P450酶在合成化学和合成生物学中的应用空间（图1）。

相关工作近日在线发表于英国皇家化学会(RSC)的旗舰期刊Chemical Science上，青岛能源所赵盼霞博士研究生、姜谊平博士、王谦为论文共同第一作者，丛志奇为通讯作者，本研究得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、以及青岛能源所自主部署的强基计划项目等的大力支持（文/图 赵盼霞、姜谊平、王谦）

文章链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/sc/d4sc02418d